in Revista MVZ Córdoba
Asociación in vitro de Duddingtonia flagrans con ivermectina en el control de nematodos gastrointestinales de búfalos
Resumen
Objetivo. El objetivo de este estudio fue evaluar la asociación in vitro del hongo Duddingtonia flagrans (AC001) e ivermectina en el control de nematodos gastrointestinales de terneros búfalo. Materiales y métodos. Se formaron cuatro grupos experimentales en microtubos, con cinco réplicas para cada grupo: G1 (nematodos + AC001), G2 (nematodos + ivermectina 1%), G3 (nematodos + AC001 + ivermectina 1%) y G4 (nematodos + agua destilada). Para cada grupo, después de 36 horas de interacción se leyó el contenido de los microtubos mediante microscopía óptica, contabilizando el número de nematodos por grupo. Resultados. Hubo una reducción larvaria significativa de los grupos tratados, con los siguientes porcentajes con relación al G4 (control): G1: 43,7%; G2: 82,3% y G3: 65,7%. También se observó que la asociación in vitro de D. flagrans con ivermectina fue más efectiva en la reducción de L3 en comparación con el uso aislado de este hongo. Conclusiones. Se concluyó que el uso conjunto de D. flagrans con ivermectina puede potenciar la eficacia del control biológico de los nematodos gastrointestinales de los búfalos, previendo su uso en las condiciones naturales de la cría de búfalos.
Main Text
INTRODUCCIÓN
Los búfalos (Bubalus bubalis) son importantes para la ganadería en varios países, principalmente en las regiones tropicales y subtropicales (1,2). En Brasil, la crianza de estos animales ha sido fuertemente impulsada debido a su triple aptitud para la producción de carne, leche y tracción, además de su fácil adaptación a ambientes inhóspitos, principalmente humedales o áreas pantanosas (3).
A pesar de ser considerado un animal resistente a la aparición de enfermedades comunes al ganado bovino, el búfalo puede verse afectado por enfermedades infecciosas y parasitarias, siendo las crías de búfalo más susceptibles a las helmintiasis (4,5). Los cambios en el manejo y el confinamiento con alta carga animal han provocado un aumento de las enfermedades parasitarias en los rebaños (6).
Ante el problema del aumento de la resistencia a los fármacos antihelmínticos, las alternativas de control parasitario han mostrado resultados promisorios, destacándose el uso del hongo Duddingtonia flagrans en el control biológico de rumiantes (7,8,9). Por otro lado, el uso combinado del control biológico con el control químico puede ser una herramienta futura viable para la salud de los rumiantes en general, reduciendo la resistencia a los antihelmínticos, los costos de manejo, la toxicidad, además de reducir los residuos químicos en la carne, la leche y el medio ambiente (10).
En este sentido, Ferraz et al. (11) demostraron que el uso de compuestos químicos fue compatible con conidios de D. flagrans, pudiendo ser utilizados en el futuro de forma conjunta en el control de Rhabditis spp., nematodo causante de otitis parasitaria en bovinos. Sin embargo, los estudios sobre el control integrado de nematodos gastrointestinales de búfalos son escasos. Así, el objetivo de este estudio fue evaluar la asociación in vitro del hongo D. flagrans e ivermectina en el control de nematodos gastrointestinales de bucerros.
MATERIAL Y MÉTODOS
Hongo. Se utilizó el aislado del hongo nematófago Duddingtonia flagrans (AC001) para obtener la solución de conidios/clamidosporas. Este hongo se encontró en suelo brasileño y se mantuvo en el Laboratorio de Parasitología de la Universidad Federal de Viçosa, Viçosa, Brasil. El aislado se distribuyó en cajas Petri de 9 cm de diámetro que contenían el medio de cultivo papa-dextrosa-agar al 2% (PDA2%). Se observó crecimiento micelial en toda la placa después de 7 días de cultivo. Para obtener la solución de conidios, se agregaron 5 ml de agua destilada a cada caja Petri y con la ayuda de una espátula se vertieron los conidios y fragmentos de micelio en tubos Falcon de 15 ml (12).
Larvas (L3). Para obtener larvas infecciosas (L3), se recolectaron muestras de heces directamente de la ampolla rectal de 114 bucerros pertenecientes a una propiedad ubicada en el sureste de Brasil, 19º 23’ 28” S y 40º 04’ 20” W. En total se utilizaron 40 muestras y de estas se utilizaron alrededor de 4 g de heces para realizar el conteo de huevos por gramo de heces (EPG), siguiendo la metodología de Gordon y Whitlock (13). Se obtuvo una media de 500 huevos/g en la prueba EPG. Realizamos cocultivos con todas las muestras positivas, que luego se almacenaron en una incubadora de demanda bioquímica de oxígeno (DBO) a 28°C durante 7 días (14). Después de este período, las larvas fueron recuperadas mediante la técnica de Baermann (15), e identificadas según los criterios mencionados por Keith (16), como Haemonchus spp., (65%), Cooperias pp. (15%), Trichostrongylus spp., (12%) y Oesophagostomum sp., (8%).
Ensayo in vitro. Se formaron cuatro grupos experimentales (Tabla 1). Cada grupo tuvo cinco repeticiones y cada réplica se realizó en microtubos de plástico de 1.5 ml con nematodos y el respectivo tratamiento. Los valores de L3 y conidios utilizados en los grupos se estandarizaron mediante alícuotas, manteniendo concentraciones de aproximadamente 100 nematodos/143 μl, 100 conidios/30 μl de AC001. Se leyó el contenido de los microtubos de cada grupo 36 horas después de la interacción de los nematodos versus AC001 o ivermectina 1% o AC001 asociado a ivermectina 1%, y se contó el número de nematodos mediante microscopía óptica, utilizando el objetivo 10x, siguiendo la metodología de Ferraz et al. (11).
Análisis estadístico. Los resultados se sometieron a la prueba de normalidad de Shapiro-Wilk. Todas las muestras mostraron una distribución normal y se sometieron al análisis de varianza (ANOVA de una vía) seguido de la prueba de Tukey al 1% de probabilidad utilizando el software BioEstat 5.0 (17). El porcentaje de reducción se calculó mediante la siguiente ecuación propuesta por Mendoza-DeGives y Vásquez-Prates (18):
Reducción (%) = (Promedio de L3 recuperados de CN – Promedio de L3 recuperados de TG)/(Promedio de L3 recuperados de CN) x 100
CN – grupo de control; TG – grupo detratamiento.
RESULTADOS
Los porcentajes de reducción de larvas infectantes se muestran en la Tabla 2. El tratamiento con conidios de D. flagrans (G1) redujo en 43.7% los nematodos recuperados después de 36 horas de interacción. En el grupo G2 (ivermectina 1%) la reducción fue del 82.3% y en el grupo G3 (ivermectina 1% + AC001) el tratamiento redujo el número de nematodos en un 65.7%, siendo superior a la actividad de AC001 solo. En el grupo de control negativo (G4) no hubo reducción de larvas.
DISCUSIÓN
Los estudios que evalúan la actividad de los hongos nematófagos en el control de los nematodos del búfalo son escasos. Ojeda-Robertos et al (19) demostraron in vitro la actividad depredadora de estos hongos contra larvas infectantes de H. contortus. Por otro lado, hasta el momento no se ha realizado ningún estudio que mencione la asociación entre hongos nematófagos y antihelmínticos químicos en L3 de nematodos parásitos del búfalo.
En el presente estudio, la cepa de D. flagrans (AC001) utilizada solo demostró eficacia en la depredación de nematodos gastrointestinales de búfalos, con una reducción del 43.7% de los nematodos recuperados después de 36 horas de interacción. Barroga et al. (20) demostraron eficacia in vitro por la acción de este hongo, después de 48 horas de interacción, se redujo el 84,39% de las larvas del búfalo.
En el grupo tratado solo con ivermectina al 1% (G2), hubo una reducción del 82.3% de los nematodos recuperados. Se observó que el tratamiento con este compuesto químico fue más efectivo al compararlo con el uso combinado con D. flagrans en relación con el uso de este hongo solo. Resultados similares fueron demostrados por Ferraz et al. (11), quienes observaron una mayor eficacia en la reducción de Rhabditis spp. con el uso aislado de ivermectina al 1% que la combinación con este hongo. La asociación de AC001 + ivermectina al 1% (G3) demostró una reducción del 65.7% de nematodos. Esta combinación fue más eficiente en comparación con el uso aislado de D. flagrans. Tales resultados revelaron que no hubo un efecto antagónico de la ivermectina sobre la capacidad de depredación de las larvas por parte del hongo. Este hallazgo es compatible con el estudio de Ferraz et al (11), quienes demostraron que la ivermectina al 1% y el dimetilsulfóxido al 1% asociados a este hongo no redujeron la depredación sobreRhabditis spp.
Vilela et al (21) observaron la eficacia de D. flagrans peletizada en matriz de alginato de sodio en asociación con Clorhidrato de Levamisol al 5% sobre nematodos gastrointestinales de ovejas. Sin embargo, estudios han demostrado una acción inhibidora de compuestos antihelmínticos sobre D. flagrans, como lo describen Sanyal et al (22) y Vieira et al (23), afectando la actividad depredadora de este hongo en el biocontrol de estos parásitos.
La literatura es amplia con respecto a la efectividad del uso de hongos nematófagos como una estrategia viable para ser implementada en un sistema integrado de control parasitário. Como se mencionó anteriormente, algunos estudios recientes han demostrado que la asociación de estos hongos con fármacos antihelmínticos ha tenido éxito en la reducción de las formas larvarias de los nematodos parásitos y, desde un punto de vista sostenible, puede convertirse en una estrategia futura (11,23, 24). Sin embargo, se entiende que el uso de algún fármaco antihelmíntico puede inhibir el desarrollo de los hongos, comprometiendo su eficacia en el control biológico (25,26). Por lo tanto, los experimentos in vitro son necesarios para probar o no la acción sinérgica de la asociación química y biológica, como se destaca aquí.
El conocimiento del papel de los medicamentos antiparasitarios y los hongos nematófagos es de suma importancia, y a través de varios buenos laboratorios y experimentos de campo, los científicos están transfiriendo este conocimiento a los productores rurales, en tiempos “oscuros”, la ciencia prevalece (23,27,28,29). En el caso del problema de la resistencia parasitaria a los antihelmínticos disponibles, se debe prestar mayor atención al uso correcto de los compuestos químicos y la implementación de un plan estratégico para el control de parásitos. Según Szewc et al (28) el uso del control biológico con hongos nematófagos puede verse como un complemento a la rutina de crianza animal. Recientemente Braga et al (9) demostraron in vitro la efectividad del producto comercial Bioverm. D. flagrans en la reducción de L3 de H. contortus (99.3%) y Strongyloides pappilosus de pequeños rumiantes.
Estos avances en el conocimiento llevaron al desarrollo de un producto de control biológico brasileño llamado Bioverm. (GhenVetSaúde Animal Ltda.), que tiene licencia para su comercialización desde 2019. La composición de Bioverm. incluye clamidosporas del hongo D. flagrans, y es indicado para el control de helmintiasis gastrointestinal en rumiantes y caballos. En búfalos, se están delineando más estudios que evalúen Bioverm. en condiciones de campo. Se concluyó que el uso in vitro de D. flagrans fue efectivo en el control de nematodos del búfalo y su asociación con ivermectina fue más eficiente que su uso solo.
Conflictos de interés
Los autores no tienen conflictos de interés para declarar que sean relevantes para el contenido de este artículo.
Aprobación ética
Los experimentos realizados en este estudio fueron aprobados y realizados de acuerdo con las recomendaciones del Comité de Ética en el Uso de Animales del Instituto Federal da Paraíba (CEUA - IFPB), bajo el protocolo número 23000.999663.2019-78.
Resumen
Main Text
INTRODUCCIÓN
MATERIAL Y MÉTODOS
RESULTADOS
DISCUSIÓN
Aprobación ética