in Revista MVZ Córdoba
Detección de Perkinsus sp. en Chionista fluctifraga cultivada en el sureste del Golfo de California
Resumen
Objetivo. Determinar la presencia de Perkinsus sp. en la almeja Chionista fluctifraga cultivada en una zona intermareal del sureste del Golfo de California, utilizando la tinción del medio fluido de tioglicolato de Ray (MFTR) y la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Material y métodos. La prevalencia y carga parasitaria de Perkinsus sp. se obtuvieron y se correlacionaron mensualmente con las condiciones ambientales del agua y los indicadores biométricos de la almeja (n=540), de mayo de 2018 a septiembre de 2019. Resultados. Se detectaron presuntas hipnosporas del protozoo en ocho meses de cultivo. La prevalencia fluctuó de 3.3% a 13.3%; la carga parasitaria osciló entre 2 y 1286 hipnosporas/g de tejido. La intensidad de la infección varió de negativa a leve. La prevalencia y la carga parasitaria se correlacionaron positivamente entre sí (r=0.61, p < 0.05), pero no con los parámetros ambientales, ni con los indicadores biométricos de la almeja. La prueba de PCR fue negativa para los casos positivos de MFTR. Conclusiones. Se detectaron presuntas hipnosporas de Perkinsus sp en C. fluctifraga sin claros indicios de infección que comprometieran la salud de la almeja en cultivo. Se recomienda el monitoreo constante de Perkinsus sp. en C. fluctifraga, para establecer posibles infecciones.
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INTRODUCCIÓN
La industria de moluscos representa una fuente importante de alimentos a nivel mundial. De acuerdo con la Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura (FAO), su cultivo aporta, aproximadamente, el 3.5% (17.1 millones de toneladas) de su producción total anual (1). En México, varias especies de almejas son valoradas tanto por su demanda para el consumo humano, como por su potencial acuícola (2,3). Sin embargo, uno de los principales “cuellos de botella” en el desarrollo de su cultivo son las enfermedades.
La Perkinsosis es un padecimiento que ha afectado la industria de los moluscos bivalvos en el mundo (4), la cual, es causada por diferentes especies del protozoario Perkinsus y, en ocasiones, se ha asociado a mortalidades masivas (5). Es tal el efecto negativo que provoca en el cultivo de moluscos, que este patógeno es considerado por la Organización Mundial de Sanidad Animal, como un parásito sujeto a declaración obligatoria (6). En México, Perkinsus marinus se reportó infectando al ostión del este Crassostrea virginica en el Golfo de México (7) y, desde hace alrededor de dos décadas, en el ostión de placer Crassostrea corteziensis del Pacífico mexicano (8). Desde hace pocos años, se han detectado protozoarios del género Perkinsus en diversas especies de poblaciones silvestres de bivalvos dentro del Golfo de California, como en el callo de hacha Atrina maura (9) y la almeja chocolata Megapitaria squalida (10). En cultivo, la presencia de P. marinus fue confirmada en la almeja arenera Chionista fluctifraga junto con el ostión japonés Crassostrea gigas en una granja al noreste del Golfo de California (11), confirmando la dispersión horizontal del patógeno entre especies en la zona.
Recientemente, C. fluctifraga fue producida en policultivo con C. gigas . M. squalida, en una zona intermareal de la costa sureste del Golfo de California, con resultados de tiempo de cosecha promisorios (12). Sin embargo, se desconoce la condición sanitaria de su cultivo con relación a la presencia de este parásito, lo cual, representaría un riesgo en su producción y de las otras especies (3). El objetivo de este estudio es evaluar la presencia de Perkinsus sp. en la almeja arenera cultivada en la bahía El Colorado, Ahome, Sinaloa, mediante su detección y confirmación con la técnica estándar de medio fluido de tioglicolato de Ray (MFTR) y la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), respectivamente, así como determinar los indicadores (prevalencia, carga parasitaria e intensidad de infección) y la relación de estos con las condiciones ambientales y biometrías de la almeja.
MATERIALES Y MÉTODOS
Colecta de organismos y toma de parámetros del agua. Mensualmente (abril 2018-septiembre 2019), se colectaron 30 almejas de Chionista fluctifraga de la parcela de cultivo intermareal perteneciente a la empresa SEA FARMERS S.A de C.V, ubicada en la bahía El Colorado, municipio de Ahome, Sinaloa. La parcela está delimitada por las siguientes coordenadas: 25° 43’ 46.30”-25° 43’ 38.70” N y 109° 33’ 54.50”-109° 23’ 47.80” O. Los especímenes fueron transportados vivos en un contenedor con agua de mar y aireación durante una hora, al Laboratorio de Malacología del Instituto Politécnico Nacional-Centro Interdisciplinario de Investigación para el Desarrollo, Integral Regional (IPN-CIIDIR), bajo las normas estándares (NOM-031-SSA1-1993, Bienes y Servicios. Productos de la pesca. Moluscos bivalvos frescos-refrigerados y congelados). Cabe destacar que el comité de Ética del Colegio de Maestros del IPN-CIIDIR, aprobó esta investigación.
También, en cada muestreo, se obtuvieron la temperatura y el oxígeno disuelto del agua con un oxímetro (YSI,5/12FT), el pH con un potenciómetro (HANNA), la salinidad con un refractómetro de precisión (Atago) y la profundidad y transparencia con un disco de Secchi. Se determinaron los sólidos suspendidos totales (SST), materia orgánica particulada (MOP) y la concentración de clorofila a (Cl-.) de acuerdo al método gravimétrico (13) y espectrofotométrico (14) para agua marina.
Indicadores biométricos e infecciosos. De cada almeja, se obtuvo la longitud (distancia máxima entre los márgenes anterior y posterior), altura (distancia máxima desde el umbo hasta el margen ventral) y el ancho de la concha (distancia máxima entre las partes más gruesas de las dos valvas) con una regla vernier digital (0.01 mm), además del peso total y peso de tejido blando (0.01 g, peso húmedo) con una balanza portátil. El tejido blando fue procesado de acuerdo a la técnica estándar del medio fluido de tioglicolato de Ray (MFTR) para detectar presuntas hipnosporas Perkinsus sp. (6). Se determinó la prevalencia (número de almejas con presuntas hipnosporas/número total de almejas) X 100 (15), carga parasitaria = número de hipnosporas por gramo de tejido de almeja (16) e intensidad de infección categorizada como: Negativa (0 hipnosporas), Ligera ( < 104 hipnosporas por gramo de tejido), Moderada (104 a 105 hinosporas por gramos de tejido) e Intensa ( > 105 hipnosporas por gramo de tejido) (17).
Para la digestión, se utilizaron 4 g de tejido de la almeja en tubos con el MFTR para ser incubados en oscuridad durante 7 días a temperatura ambiente. Cuando el tejido pesaba menos de 4 g (almejas pequeñas), se utilizaba todo el organismo en la digestión. Posteriormente, se añadieron 35 mL de NaOH 2M para digerirlos durante 60 min a 60°C. Finalmente, los tubos se centrifugaron (2.000 rpm por 3 min), se desechó el NaOH 2M y se enjuagó con agua destilada conservando el sedimento de la muestra (6). Para la extracción del ADN de las esporas, las muestras se lavan con agua destilada y, al microscopio (10X), se rompe la pared de las esporas con una aguja de punta fina. Finalmente, a la muestra (aproximadamente 100 µL) se adiciona 1 mL de DNAzol ® y 5 µL de proteinasa K ( 6).
El ADN obtenido de las digestiones y extracciones tanto de las hipnosporas como del tejido de branquias, fue utilizado como ADN blanco en la reacción electroforética de PCR (6). Se utilizaron los oligonucleótidos PerkITS85 (5’-CCG-CTT-TGT-TTG-GAT-CCC-3’) y PerkITS750 (5’-ACA-TCA-GGC-CTT-CTA-ATG-ATG-3’) que detectan cualquier especie de Perkinsus sp. (18), y los oligonucleótidos específicos PmarITS-70F (5’-CTT-TTG-YTW-GAG-WGT-TGC-GAG-ATG-3’) y PmarITS600R (5’-CGA-GTT-TGC-GAG-TAC-CTC-KAG-AG-3’) para P. marinus (19).
Como control positivo se utilizó ADN genómico de C. corteziensis infectado con P. marinus (20), y como control negativo se agregó agua en lugar de ADN.
Análisis estadístico. Los datos que no mostraron una distribución normal (parámetros ambientales e indicadores infecciosos, Kolmogorov-Smirnov) fueron transformados (raíz cuadrada) antes de analizarlos estadísticamente. Se aplicaron correlaciones multivariadas (., Pearson) entre los indicadores infecciosos y el resto de los parámetros (ambientales del sitio de muestreo y biométricos de la almeja) con un nivel de significación de 0.05. Se utilizó el programa Statgraphics Centurion XVII.
RESULTADOS
Los intervalos de los parámetros del agua fueron: temperatura = 15.9 °C en febrero 2019 a 32.1 °C en septiembre 2019; salinidad = 25 g sal/L en septiembre 2018 a 40 g sal/L en marzo 2019; oxígeno disuelto = 5.14 mg/L en agosto 2018 a 9.63 mg/L en abril 2018; pH = 4.3 en agosto 2018 a 8.21 en marzo 2019; profundidad = 0.20 m en marzo 2019 a 1.15 m en septiembre 2019; transparencia = 0.16 m en abril 2019 a 0.8 m en octubre 2018 y septiembre 2019; Cl-. = 2.2 mg/m3 en agosto 2019 a 10.5 mg/m3 en noviembre 2018; SST = 19.3 mg/L en julio 2018 a 189.2 mg/L en noviembre 2018; y MOP = 4.8 mg/L en junio 2018 a 26.3 mg/L junio 2019. La Tabla 1 muestra los valores biométricos de la almeja por cada mes.
Durante en análisis al microscopio óptico (X10 y X40) de las muestras de tejido de la almeja, se detectaron corpúsculos redondos, esféricos, de color azul oscuro y con un diámetro entre 20 a 70 µm (Figura 1) con la tinción MFTR, características estándares de presuntas hipnosporas del protozoario (4,6).
La prevalencia y carga parasitaria presentaron un intervalo de 0 a 13.33% y de 2 a 1,286 hipnosporas por gramo de tejido (Figura 2). La intensidad de infección en todos los meses de cultivo fue de nula (abril, julio, septiembre, octubre, noviembre y diciembre de 2018, y enero, febrero, marzo, mayo, junio, julio, agosto y septiembre de 2019) a ligera (mayo y agosto de 2018, y abril de 2019).
De las 19 almejas que resultaron positivas a la tinción con MFTR (3.5%), no se obtuvo la confirmación para Perkinsus sp. ni para P. marinus con la prueba de PCR. No se presentó correlación entre los indicadores infecciosos con los parámetros del agua y biométricos de la almeja, pero si entre la prevalencia y carga parasitaria (.=0.61, p<0.05).
DISCUSIÓN
A pesar de que los parámetros ambientales registrados se encontraron dentro del rango para el cultivo de almejas (21), nuestros valores registraron un intervalo más amplio a trabajos reportados en la misma bahía (22,23). Lo anterior, puede explicarse, parcialmente, a la duración de los tiempos experimentales entre las investigaciones y a las condiciones inherentes de un cultivo en zona intermareal, que sufre exposición cíclica a la intemperie. Por otro lado, las biometrías mostraron un crecimiento constante de C. fluctifraga durante los 18 meses (12), sin señales de afección por los indicadores ambientales registrados.
Los diferentes componentes del tejido blando de C. fluctifraga no mostraron daño aparente característico de Perkinsosis (tejido acuoso y delgado, lentitud en el cierre de las valvas y corpúsculos blanquecinos, 6) bajo observación visual y al microscopio. Sin embargo, la tinción de MFTR detectó presuntas hipnosporas del protozoario en el tejido de las almejas, en 8 meses del cultivo, sin presentar una tendencia dictada por los parámetros ambientales. Lo anterior, coincide con los reportes de otros autores (20,27) estudiando diversos bivalvos cerca de la zona de estudio, quienes mencionan que los indicadores infecciosos no estuvieron correlacionados con las fluctuaciones de los parámetros del agua, incluyendo la temperatura y salinidad, principales indicadores reconocidos como promotores de la infección (4). La detección de hipnosporas de Perkinsus sp y Perkinsus marinus ha sido previamente reportada en diferentes especies bivalvos en el Golfo de California en México (9,10), incluyendo en la almeja arenera (11), pero su presencia no ha sido asociada a infecciones graves o mortalidades. La prevalencia promedio de Perkinsus sp. en C. fluctifraga obtenida con MFTR (3.5%), fue menor a la reportada en un cultivo ubicado al norte de la costa este del Golfo de California para la misma especie (11), al igual que para otras especies de moluscos bivalvos en el Golfo de California (8,24). Además, la carga parasitaria promedio de Perkinsus sp. en 18 meses de cultivo de la almeja arenera (195 hipnosporas/g), asociada a una ligera intensidad de infección, sugieren que: 1) las condiciones ambientales del sitio guardan características sanitarias favorables para su cultivo (25)–lo cual, concuerda con su clasificación como zona certificada para el cultivo de moluscos- y, 2) en concordancia con otras almejas (10,26) estudiadas cerca de la zona de estudio, C. fluctifraga no muestra daños tisulares por este patógeno (4).
La prevalencia y la carga parasitaria del protozoario no se correlacionaron con ningún parámetro ambiental o biométrico del hospedero, lo cual, coincide con lo documentado para C. gigas cultivado en la misma bahía (27). Por lo tanto, es posible inferir que las condiciones del lugar se han mantenido estables, sin afectar la condición sanitaria de los bivalvos estudiados en dicho lugar. Sin embargo, los resultados del presente estudio son diferentes a los reportados para especies silvestres de M. squalida al sur del sitio de cultivo, donde los indicadores infecciosos del protozoario si mostraron correlación con las dimensiones de la almeja chocolata y la salinidad (10,26). La diferencia en los resultados con organismos adultos silvestres pudiera explicarse por el mayor periodo de tiempo a que estos han estado expuestos al parásito antes de ser muestreados, además de las condiciones ambientales de cada zona.
A pesar de la sensibilidad y especificidad de la técnica con PCR (6), no se detectó el patógeno debido, probablemente, a los bajos valores de los indicadores infecciosos que se expresan en poco o nulo material genético (ADN) disponible para realizar la prueba, lo que coincide con el grado en la intensidad de infección de las almejas, que fue de nula a ligera. La tinción con tioglicolato mostró presuntas hipnosporas del parásito, pero con baja prevalencia y cantidad de presuntas hipnosporas por gramo de teijdo. La diferencia encontrada tanto en MFTR como PCR puede ser atribuida a la cantidad de tejido analizada en cada prueba. Para la prueba con la tinción de tioglicolato se usaron 4 g de tejido, mientras que para la prueba PCR, se utilizaron aproximadamente 50-100 mg en la extracción del ADN. Lo mismo fue observado para otras especies de bivalvos en la región (9,27,28).
Ya que C. fluctifraga creció de manera constante, sin presentar signos de infección, es posible concluir que el estado sanitario de su cultivo en la zona intermareal del sureste del Golfo de California no se encontraría comprometido por la presencia de Perkinsus sp. No obstante, debido a su dispersión y detección en diferentes bivalvos de la zona, es recomendable el monitoreo constante del parásito en futuros cultivos y sus zonas aledañas.
Conflicto de intereses
Los autores declaran que no existió conflicto de intereses de ningún tipo durante la realización y elaboración de este trabajo.
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