Objetivo. Analizar el efecto del xilano y la cascarilla de arroz como únicas fuentes de carbono, sobre la actividad feruloil esterasa y la expresión de los genes faeA y faeB de Penicillium rubens (Wisconsin 54-1255), en fermentación sumergida. Materiales y métodos. Las fermentaciones se realizaron durante 24, 48 y 72 h (28°C/250 rpm), en matraces con medio Sakamoto modificado. La actividad FAE se determinó usando el sustrato sintético Etil 4-hidroxi-3-metoxicinamato. La transcripción de faeA y faeB fue determinada por RT-PCR. Los productos de PCR fueron resueltos por electroforesis en gel y se analizaron por densitometría. Resultados. El análisis de la expresión génica evidenció que el uso del xilano tuvo un efecto positivo en la expresión de ambos genes. La mayor actividad transcripcional, tanto de faeA como de faeB, se observó a las 48 h. Por su parte, la cascarilla de arroz produjo resultados negativos. Los datos obtenidos al determinar la actividad feruloil esterasa, respaldaron los resultados observados en el análisis de expresión génica. Conclusión. A diferencia del xilano, la cascarilla de arroz no demostró un efecto inductor sobre la actividad feruloil esterasa en P. rubens.

Las feruloil esterasas (EC. 3.1.1.73) pertenecen a las hidrolasas de éster carboxílico y son las enzimas clave en la escisión de los enlaces éster entre el ácido hidroxicinámico y la galactosa o arabinoxilanos, en la hemicelulosa. Este grupo de esterasas también es conocido por sus siglas: FAE (ferulic acid esterases). La hidrólisis de los enlaces éster en las paredes celulares de las plantas usando enzimas FAE permite que los polisacáridos y diferentes compuestos fenólicos como los ácidos hidroxicinámicos se liberen fácilmente (1). Los ácidos hidroxicinámicos son productos químicos de alto valor debido a sus diversas propiedades biológicas, de los cuales el ácido ferúlico es el más abundante y ampliamente distribuido (2). Muchos estudios han informado sobre las aplicaciones del ácido ferúlico en la industria alimentaria, biomédica y farmacéutica debido a sus propiedades antioxidantes, antimicrobianas, antivirales, anticancerígenas y antiinflamatorias (2,3). En consecuencia, el uso de enzimas FAE es muy importante en diferentes procesos biotecnológicos como: la hidrólisis enzimática para la producción de bioetanol, la deslignificación biológica de plantas para la producción de papel, la esterificación del ácido hidroxicinámico, así como la digestibilidad y el aumento de la recuperación de residuos vegetales derivados de la agroindustria (1,3).

La producción de feruloil esterasas a partir de microorganismos y su aplicación biotecnológica han sido objeto de investigación en los últimos años. Actualmente, los hongos filamentosos son el grupo de microorganismos más empleado en la búsqueda y producción de estas enzimas. Sin embargo, la cantidad de secuencias fúngicas depositadas en las bases de datos aún es baja (4). En algunos casos, se ha informado la actividad enzimática e incluso se han purificado las enzimas sin llegar a conocer las secuencias de los genes que las codifican. Esta es la situación de Penicillium rubens (anteriormente clasificado como P. chrysogenum), uno de los hongos más valiosos para la industria de la biotecnología (5). Afortunadamente, el carácter público de los genomas fúngicos ha facilitado la búsqueda de secuencias codificantes de enzimas FAE mediante minería genómica. Después de una búsqueda, basada en similitud, en el genoma de P. rubens (Wisconsin 54-1255), se encontraron dos secuencias codificantes de feruloil esterasas que fueron denominadas faeA y faeB. Se encontró que faeA contiene un marco de lectura abierto (ORF-Pc20g07010) de 933 pb, con un solo intrón (89 pb), que codifica una proteína de 280 aminoácidos llamada PrFaeA (CAP86030). Por otro lado, faeB incluye un marco de lectura abierto (ORF-Pc12g08300) de 1643 pb, con un intrón de 58 pb, que codifica para una proteína de 527 aminoácidos denominada PrFaeB (CAP80457). Ambas proteínas fúngicas fueron verificadas bioinformáticamente, determinando que pertenecen a las enzimas FAE tipo A y B, respectivamente.

Teniendo en cuenta que la cascarilla es uno de los subproductos generados en gran cantidad durante la producción de arroz y que es rica en hemicelulosas y compuestos fenólicos (6), se ha considerado evaluar su uso como sustrato en la producción de enzimas FAE por P. rubens (Wisconsin 54-1255) en condiciones de fermentación sumergida. Por lo tanto, este trabajo tuvo como objetivo analizar el efecto de la cascarilla de arroz sobre la actividad enzimática feruloil esterasa y sobre la transcripción de los genes codificadores para las feruloil esterasas PrFaeA y PrFaeB, en comparación con el uso de xilano como única fuente de carbono.

Fermentación. Se tuvo en cuenta el medio de cultivo descrito por Sakamoto et al (10), con modificaciones (NH.NO.: 2 gl − 1; K.HPO.: 1 gl − 1; MgSO. · 7 H.O: 0.5 gl − 1; KCl: 0.5 gl − 1; FeSO.: 0.01 gl − 1; peptona de soja: 1 gl − 1; cascarilla de arroz: 20 gl − 1; agua destilada). La cascarilla de arroz se sometió a un pretratamiento de molienda y cribado para posteriormente ser sometida a solubilización en autoclave mediante tratamiento térmico con vapor. El medio de cultivo así preparado se llamó RHS (rice-husk-sakamoto). Para preparar el segundo medio de cultivo, la cascarilla de arroz fue reemplazada por xilano (2%). Este medio se denominó XS (xilano-sakamoto). Para la determinación de la actividad enzimática, las fermentaciones se llevaron a cabo durante 24, 48 y 72 h, a 28°C y 250 rpm, en matraces de 250 ml con 50 ml de medio. Para obtener los extractos enzimáticos, el contenido de cada matraz se procesó como lo describe Sakamoto et al (7). La cantidad de proteína presente en cada extracto se midió utilizando el método Bradford. La actividad feruloil esterasa se determinó usando el sustrato sintético 4-hidroxi-3-metoxicinamato de etilo (Sigma-Aldrich) siguiendo el procedimiento propuesto por Sakamoto, et al (7). Para estos experimentos, U se define como la cantidad de enzima que es capaz de liberar 1 µmol de AF en un tiempo de 1 minuto.

Análisis de la expresión génica. Se realizaron fermentaciones durante 72 h, a 28°C y 250 rpm, en matraces de 500 ml con 100 ml de medio. Las muestras de micelio fueron tomadas, de cada medio de cultivo, a las 24 h, 48 h y 72 h. Las extracciones de ADN y ARN se realizaron según lo indicado por Gil-Durán et al (8). La transcripción de faeA, faeB y actA se analizó por RT-PCR. La síntesis de ADNc se realizó según lo descrito por García-Rico et al (9). La amplificación por PCR se realizó siguiendo estas condiciones: 5 min a 94°C; 30 s a 94°C; 30 s a 58°C; 30 s a 72°C (35 ciclos) y 10 min a 72°C. Los oligonucleótidos utilizados se indican en la Tabla 1.

Los productos de PCR se resolvieron por electroforesis en gel. Teniendo en cuenta el tamaño de los amplicones, se utilizó como marcador de peso molecular el DNA Ladder GeneRuler de 50 pb (ThermoFisher). Para el control positivo, se usó ADN genómico de P. rubens como molde, mientras que para el control negativo no se utilizó molde. El análisis de densitometría se realizó utilizando el software “MYImageAnalysis” (ThermoFischer) según lo descrito por Torrent et al (10). El gen normalizador fue actA.

El análisis de la actividad enzimática (actividad FAE) de los medios de cultivo RHS y XS, produjo resultados que contrastan entre sí. Por un lado, se observó que la actividad FAE en el medio RHS fue nula, mientras que en el medio XS se detectó actividad enzimática en todos los tiempos ensayados. El uso de xilano como única fuente de carbono indujo una actividad FAE cuyo punto de máxima actividad se observó a las 48 h, momento en el cual se duplicó la actividad detectada a las 24 h (Figura 1). La actividad enzimática a las 72 h osciló alrededor del 90% de los valores observados a las 48 h.

Se muestran los datos obtenidos a las 24 h, 48 h y 72 h de fermentación sumergida en los medios XS y RHS. Las barras de error representan la desviación estándar de dos réplicas de dos experimentos independientes (p<0.05). (U) Unidad: cantidad de enzima que es capaz de liberar 1 µmol de AF en un tiempo de 1 minuto.

De manera similar, el análisis de expresión génica indicó que, a diferencia de la cascarilla de arroz, el uso de xilano produjo un efecto inductor sobre la expresión génica de faeA y faeB. Cuando los productos de RT-PCR se resolvieron por electroforesis, el amplicón del tamaño esperado (100 pb) solamente se observó en la fermentación con medio XS (Figura 2). En el medio XS, la actividad transcripcional de faeA se detectó desde las 24 h hasta las 72 h de la fermentación, mientras que para faeB la expresión se observó claramente solo después de las 48 h de cultivo (Figura 2B).

El análisis por densitometría mostró que faeA alcanzó su nivel máximo de expresión a las 48 h (Figura 3). A las 72 h, el nivel relativo de actividad transcripcional en el micelio permaneció alrededor del 70% en comparación con los niveles de transcripción de actA, utilizado como gen normalizador debido a su carácter constitutivo. A diferencia de faeA, la expresión de faeB no se detectó a las 24 h. Sin embargo, la mayor actividad transcripcional se observó a las 48 h. Después de 72 h, la expresión relativa de faeB disminuyó a menos de la mitad de lo que se observó a las 48 h (Figura 3). Para ambos genes, los niveles más altos de expresión se detectaron a las 48 h de fermentación, lo cual es consistente con lo observado en los análisis de actividad enzimática. Por su parte, la cascarilla de arroz produjo resultados opuestos (Figuras 1 y 2). No se detectó actividad transcripcional, en los tiempos ensayados, para ninguno de los dos genes. Por lo tanto, el medio Sakamoto modificado con cascarilla de arroz no funcionó como inductor de la actividad feruloil esterasa en .. rubens.

En la figura 3, se muestran los datos obtenidos a las 24 h, 48 h y 72 h de fermentación sumergida en medio XS. Los niveles de transcripción de faeA y faeB se cuantificaron por densitometría. El gen normalizador fue actA. Las relaciones faeA/actA y faeB/actA se expresaron como porcentaje (10).

En los hongos filamentosos, los genes que codifican para feruloil esterasas están regulados mediante represión por catabolito. Normalmente, este control negativo está mediado por CreA que reprime a XlnR, un activador transcripcional de genes xilanolíticos (11). Nuestros resultados mostraron que el xilano tuvo un mayor efecto inductor en faeA que en faeB, durante toda la fermentación. Esta diferencia fue especialmente importante a las 24 h (Figura 2). En Aspergillus niger, azúcares como la xilosa y la arabinosa indujeron diferencialmente la expresión de faeA en detrimento de faeB, después de unas pocas horas de crecimiento (12). Lo anterior concuerda con lo observado en P. rubens, especialmente si consideramos que el producto principal de la hidrólisis de xilano es la xilosa. Adicionalmente, la concentración de xilosa tiene un impacto en la expresión génica. A bajas concentraciones, la xilosa funciona como inductor y a altas concentraciones como represor, en un mecanismo mediado por CreA (13). Este comportamiento explicaría la disminución que se observó en la transcripción de faeAdespués de las 48 h, ya que podría obedecer al aumento de xilosa, producto de la actividad hidrolítica. Por otra parte, en A. niger el gen faeB es inducido por la presencia de compuestos aromáticos como el ácido ferúlico (4). Por lo tanto, en presencia de polisacáridos complejos, la expresión del gen faeA condujo a la liberación de estos compuestos aromáticos específicos, propiciando posteriormente la expresión de faeB. Adicionalmente, en este trabajo reportamos el efecto nulo que ejerce la cascarilla de arroz sobre la transcripción de los genes que codifican para enzimas FAE. En sustratos naturales, las hemicelulosas son químicamente muy variables. En particular, los arabinoxilanos de las cáscaras de cereales se describen como los más lignificados, con la mayor diversidad de cadenas laterales y, a veces, insolubles en agua (14). Esto permite suponer que algunos componentes como el xilano y el ácido ferúlico pueden ser inaccesibles para operar como inductores en la expresión génica. Finalmente, se debe considerar la posible generación de compuestos inhibidores durante el pretratamiento de la cascarilla de arroz. En el tratamiento previo con vapor, la degradación parcial de la hemicelulosa puede conducir a la generación de compuestos tóxicos como los derivados del furano (furfural y 5-hidroximetilfurfural) que afectan la actividad enzimática (15).

Los autores declaran que no hay conflicto de intereses.